ДНК-ДИАГНОСТИКА АНАПЛАЗМОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Цель исследования – разработка метода ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота.  Материалы и методы. Пробы крови отбирали из хвостовой вены с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M. Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам Anaplasma marginale. Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера СlustalW2. Видоспецифичность праймеров проверяли с использованием алгоритма BLASTN. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в течение 40 минут при напряженности поля 5 В/см. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены, лигированы и клонированы в клетках E. coli. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5α, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 °С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера и генетического анализатора Applied Biosystems 3130. Результаты и обсуждение. Описаны разработка и апробация праймеров к гену msp4Anaplasma marginale для ДНК-диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота методом ПЦР. Чувствительность ПЦР с использованием этих праймеров позволяет выявить 100 и больше копий гена. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода.

1. Василевич Ф. И., Белименко В. В., Гулюкин М. И., Георгиу Х. Практическое руководство по борьбе с кровепаразитарными болезнями домашних животных. – Москва: ЗооВетКнига, 2015. – 86 с.

2. Георгиу Х., Белименко В. В. Современные лабораторные методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец // РВЖ. СХЖ. – 2014. – № 3. – С. 31–32.

3. Глазко В. И., Косовский Г. Ю., Ковальчук С. Н. и др. Инвертированный повтор микросателлита (AGC)6G фланкирует районы ДНК с участками гомологии к ретротранспозонам в геноме крупного рогатого скота // Инновационные технологии в медицине. – 2014. – № 2, Т. 3. – С. 63–79.

4. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007–2012) // РВЖ. СХЖ. – 2013. – № 2. – С. 36–40.

5. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. и др. Кровепаразитарные болезни домашних животных (Атлас). – Москва: ЗооВетКнига, 2013. – 86 с.

6. Carelli G., Decaro N., Lorusso A. et al. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR // Vet. Microbiol. – 2007. – Vol. 124. – P. 107–114.

7. de la Fuente J., Lew A., Lutz H. et al.Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development // Anim. Health Res. Rev. – 2005. – Vol. 6. – P. 75–89.

8. de la Fuente J., Van Den Bussche R. A., Kocan K. M. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae) // Vet Parasitol. – 2001. – Vol. 97. – P. 65–76.

9. Fyumagwa R. D., Simmler P., Meli M. L. et al. Prevalence of Anaplasma marginale in different tick species from Ngorongoro Crater, Tanzania // Vet Parasitol. – 2009. – Vol. 161, № 1–2. – P. 154–157.

10. Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F. et al. The natural history of Anaplasma marginale // Vet. Parasitol. – 2010. – Vol. 167. – P. 95–107.

11. Potgieter F. T., Stoltsz W. H. Anaplasmosis // Infectious Diseases of Livestock With Special Reference to Southern Africa. – 1994. – P. 408–430.

12. Reinbold J. B., Coetzee J. F., Sirigireddy K. R., Ganta R. R. Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in Bovine Peripheral Blood Samples by Duplex Real–Time Reverse Transcriptase PCR Assay // Journal of clinical microbiology. – 2010. – Vol. 48, № 7. – P. 2424–2432.

13. Strik N. I., Alleman A. R., Barbet A. F. et al. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale // Clin. Vaccine Immunol. – 2007. – Vol. 14. – P. 262–268.

14. Torina A., Agnone A., Blanda V. et al. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale // Ticks Tick Borne Dis. – 2012. – Vol. 3, № 5–6. – P. 283–287.

15. Visser E. S., McGuire T. C., Palmer G. H. et al. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19-kilodalton protein conserved in all recognized Anaplasma species // Infect Immun. – 1992. – Vol. 60, № 12. – P. 5139–5144.