Метод времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF) для исследования белкового профиля гельминтов промысловых рыб

Цель исследований – отработать метод пробоподготовки, используя расходные материалы (лизис-буферы) российского производства, для изучения белкового профиля санитарно-значимых гельминтов промысловых рыб методом времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF).

Материалы и методы. Для работы были отобраны 98 экз. гельминтов от трех видов рыб: половозрелые цестоды Triaenophorus nodulosus из кишечника щуки (Esox lucius), плероцеркоиды (личинки) цестод Diphyllobothrium ditremum из стенки желудка и кишечника ряпушки европейской (Coregonus albula), личинки нематод Eustrongylides excisus из мышечной ткани и печени окуня обыкновенного (Perca fluviatilis). Ихтиологический материал был получен с помощью пассивных орудий лова (сети) в период с января по август 2025 года и доставлен в лабораторию в замороженном виде. В лабораторных условиях проводили вскрытие рыб, осмотр мышечной ткани и внутренних органов под бинокулярным микроскопом Motic SMZ-171T. Для видовой идентификации паразитов использовали определители паразитов пресноводных рыб фауны СССР Гусева (1985) и Авдеева (1987). Фотодокументацию выполняли на микроскопе Zeiss AxioImager Z.1. Пробоподготовку (экстракцию) гельминтов проводили согласно патенту N RU 2768162 C1 «Способ подготовки половозрелых особей нематод для идентификации методом MALDI TOF масс-спектрометрии» (2022). Масс-спектрометрию гельминтов выполняли на масс-спектрометре MALDI (Microflex, Bruker Germany).

Результаты и обсуждение. На сегодняшний день в Российской Федерации имеется необходимость в разработке, верификации и внедрении в практическую деятельность испытательных лабораторий рабочих протоколов метода MALDI-TOF MS для диагностики инвазий рыб, используемых для пищевых целей, и создания единой референсбиблиотеки спектров белков гельминтов, встречающихся на территории России. Однако, метод пробоподготовки (экстракции) гельминтов не отработан и не разработан стандартный операционный протокол для проведения диагностического исследования гельминтов методом времяпролетной масс-спектрометрии. Нами предприняты исследования по отработке метода пробоподготовки (экстракции) гельминтов с использованием расходных материалов и реактивов российского производства. В результате проведенных нами исследований был отработан протокол пробоподготовки и получен 41 масс-спектр.

1. Авдеев В. В., Бауер О. Н., Быховская-Павловская И. Е., Вайнштейн Б. А., Висманис К. О., Гусев А. В., Дубинина М. Н., Кулакова А. П., Ломакин В. В., Ройтман В. А., Семенова М. К., Скрябина Е. С., Старобогатов Я. И., Трофименко В. Я., Эпштейн В. М. Определитель паразитов пресноводных рыб фауны СССР. В 3 т. Паразитические многоклеточные. Ч. 2. Т. 3. Л.: Наука, 1987. 583 с.

2. Алешукина А. В., Алешукина И. С., Ермакова Л. А., Нагорный С. А., Пшеничная Н. Ю., Криворотова Е. Ю. Способ подготовки проб материала для идентификации вида нематод методом MALDI TOFF Biotyper. Патент № RU 2703280 C1. Опубликовано: 16.10.2019. Бюл. № 29

3. Асланова М. М., Ракитина Д. В., Мания Т. Р., Абрамов И. А., Сергиев В. П. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ возбудителей паразитарных болезней: современное состояние и перспективы // Гигиена и санитария. 2022. Т. 101. № 5. С. 583-588. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-5-583-588

4. Березинская И. С., Алешукина А. В., Нагорный С. А. Современный способ пробоподготовки для идентификации аскарид на базе массспектрометрии // «Проблемы эпидемиологии, микробиологии и гигиены»: материалы ХV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. Нижний Новгород, 2023. С. 241-244.

5. Видманова М. В., Лямин А. В., Казаков В. С., Исматуллин Д. Д. Способ подготовки половозрелых особей нематод для идентификации методом MALDI TOF масс-спектрометрии. Патент № RU 2768162 C1. Опубликовано: 23.03.2022 Бюл. № 9.

6. Гусев А. В., Дубинина М. Н., Пугачев О. Н., Райкова Е. В., Хотеновский И. А., Эргенс Р. Определитель паразитов пресноводных рыб фауны СССР. В 3 т. Паразитические многоклеточные, ч. 1. Т. 2. Л.: Наука, 1985. 425 с.

7. Нагорный С. А., Алешукина А. В., Алешукина И. С., Ермакова Л. А., Пшеничная Н. Ю. Перспектива применения протеомного анализа на основе MALDI-TOF MS для дифференциации нематод на примере изучения белковых профилей аскарид и дирофилярий // Паразитология. 2019. 53 (2). С. 136–44. https://doi.org/10.1134/S0031184719020054

8. Нагорный С. А., Алешукина А. В., Алешукина И. С., Ермакова Л. А. Использование метода MALDI-TOF MS для видовой дифференциации нематод (на примере изучения белковых профилей аскаридат и дирофилярий) // «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»: сборник научных статей по материалам международной научной конференции. 2020. Вып. 21. С. 267–275. https://doi.org/10.31016/978-5-9902341-5-4.2020.21.267-275

9. Ahmad F., Gopal J., Wu H. Rapid and highly sensitive detection of single nematode via direct MALDI Mass Spectrometry. Talanta. 2012; 93: 182-185.

10. Avila C. C., Almeida F. G., Palmisano G. Direct identification of trypanosomatids by matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (DIT MALDI-TOF MS). Journal of Mass Spectrometry. 2016; 51 (8): 549-557.

11. Calderaro A., Buttrini M., Montecchini S., Rossi S., Piccolo G., Arcangeletti M. C., Medici M. C., Chezzi C., De Conto F. MALDI-TOF MS as a new tool for the identification of Dientamoeba fragilis. Parasites & Vectors. 2018; 11: 11. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2597-3

12. Huguenin A., Depaquit J., Villena I.; Ferté H. MALDI-TOF mass spectrometry: a new tool for rapid identification of cercariae (Trematoda, Digenea). Parasite. 2019; 26: 11-13. https://doi.org/10.1051/parasite/2019011

13. Karadjian G., Bilska-Zaja E., Bahn P., Py J.-S., Johne A., Gassilloud B., Róz˙ycki M., Cencek T., Mayer-Scholl A., Vallée I. Species identification of Trichinella originated from various host and different geographical location by MALDI-TOF. Experimental Parasitology. 2020; 213. 107890. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2020.107890

14. León I. R., Neves-Ferreira A. G. C., Valente R. H., Mota E. M., Lenzi H. L., Perales J. Improved protein identification efficiency by mass spectrometry using N-terminal chemical derivatization of peptides from Angiostrongylus costaricensis, a nematode with unknown genome. Journal of Mass Spectrometry. 2007; 42 (6): 781-792

15. Marzano V., Pane S., Foglietta G., Levi Mortera S., Vernocchi P., Onetti Muda A., Putignani L. Mass spectrometry based-proteomic analysis of Anisakis spp.: a preliminary study towards a new diagnostic tool. Genes. 2020; 11. 693. https://doi.org/10.3390/genes11060693

16. Rivero J., Zurita A., Cutillas C., Callejón R. The use of MALDI-TOF MS as a diagnostic tool for adult Trichuris species. Frontiers in Veterinary Sciense. 2022; 9. 867919. https://doi.org/10.3389/fvets.2022.867919

17. Sy I., Margardt L., Ngbede E. O., Adah M. I., Yusuf S. T., Keiser J., Rehner J., Utzinger J., Poppert S., Becker S. L. Identification of adult Fasciola spp. using matrix-assisted laser/desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. Microorganisms. 2020; 9. 82. https://doi.org/10.3390/microorganisms9010082