Опыт культивирования in vivo и in vitro эпизоотического штамма Anaplasma ovis для производства иммунобиологических средств

Цель исследований – сравнение различных схем заражения животных-доноров до и после спленэктомии, а также изучение возможности накопления анаплазм in vitro в культуре эритроцитов мелкого рогатого скота для оценки интенсивности инвазии.

Материалы и методы. Для заражения использовали штамм Anaplasma ovis Lestoquard, 1924, Kadom_1, номер доступа в GenBank – OP557971 из исследовательской коллекции ФНЦ ВИЭВ РАН. Опыт in vivo проводили на двух группах коз, при этом животным первой группы (n = 6) вводили анаплазмы от барана-донора до спленэктомии, а животным второй группы (n = 6) – на вторые сутки после спленэктомии. На высоте паразитемии коз обескровили и провели оценку интенсивности инвазии. Для культивирования in vitro вносили стерильную кровь барана-носителя анаплазм в стерильную кровь барана-донора, свободного от анаплазм, в соотношении 1 : 10. Кровь инкубировали при температуре 35 °С и скорости перемешивания 60 об/мин 7 сут. Микроскопию крови проводили на 3, 5 и 7-е сутки культивирования. Наличие анаплазм определяли в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимза. Результаты подтверждали методом ПЦР.

Результаты и обсуждение. Сравнительный анализ двух протоколов выявил преимущество первой группы с реализацией схемы с предварительным заражением коз и последующей спленэктомией. Максимальный уровень паразитемии составил 76,90±1,18% к 55-м суткам. Результаты культивирования анаплазм in vitro в стерильной дефибринированной крови барана показали, что после заражения культуры эритроцитов на 5-е сутки культивирования уровень паразитемии был 18,13±0,25%. К 7-м суткам уровень паразитемии вырос до 29,7±1,04%, а в некоторых эритроцитах отмечали до трех анаплазм. Полученные результаты демонстрируют альтернативную возможность поддержания и размножения анаплазм вне организма хозяина. Это позволит в будущем отказаться от животных-доноров и усовершенствовать технологию изготовления антигенов для производства диагностикумов и вакцин.

1. Георгиу Х. Разработка способа получения анаплазменного антигена для серологической диагностики анаплазмоза овец // Ветеринария и кормление. 2013. № 6. С. 30-34.

2. Георгиу Х., Хамурзов Р. М., Горбунова Е. М., Орел В. Г. К вопросу о диагностике анаплазмоза крупного и мелкого рогатого скота // Ветеринарная патология. 2008. № 2. С. 41-45.

3. Горбатов А. В., Чулкина И. А. Современная таксономия анаплазмоза животных // «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»: сборник научных статей по материалам международной научной конференции. 2022. Вып. 23. С. 142-148. https://doi.org/10.31016/978-5-6046256-9-9.2022.23.142-148

4. Лощинин М. Н. Молекулярно-генетическая и серологическая диагностика анаплазмоза овец // Ветеринария. 2022. № 9. С. 40-44. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2022.25.9.40-44

5. Лощинин М. Н., Мальцева О. Е., Журавлева Е. А., Алексеенкова С. В. Сравнение схем получения высокоактивного антигена для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РСК // Труды Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко. 2023. 83(1). С. 67-72. https://doi.org/10.31016/viev-2023-83-1-10

6. Мальцева О. Е., Журавлева Е. А., Алексеенкова С. В., Лощинин М.Н. Получение высокоактивного антигена и специфической сыворотки для диагностики анаплазмоза рогатого скота // Ветеринария. 2023. № 9. С. 29-33. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2023.26.9.29-33

7. Прохорова В. Г., Кошкина Н. А. Современная эпизоотическая ситуация по анаплазмозу овец в Ставропольском крае // Вестник ветеринарии. 1996. № 1. С. 35-37.

8. Abbas Zadeh M., Hamidinejat H., Nikvand A. A., Jalali S. M., Bahrami S. Molecular and haematological investigations on Anaplasma ovis infection in goats in Ahvaz, Iran: Insights into infection rate, haemolytic effect and breed influences // Veterinary Medicine and Science. 2024; 10 (2): e1404. https://doi.org/10.1002/vms3.

9. Doyle R. L., França R. T., Oliveira C. B., Rezer J. F. P., Klafke G. M., Martins J. R., Santos A. P., do Nascimento N. C., Mesick J. B., Lopes S. T. A., Leal D. B. R., Da Silva A. S., Andrade C. M. Cattle experimentally infected by Anaplasma marginale: Influence of splenectomy on disease pathogenesis, oxidative profile, and antioxidant status // Microbial Pathogenesis. 2016; 95: 193-199. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2016.04.011

10. Hendrix G. K., Brayton K. A., Burcham G. N. Anaplasma ovis as the suspected cause of mortality in a neonatal elk calf // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2019; 31 (2): 267-270. https://doi.org/10.1177/1040638719830456

11. Hornok S., Meli M. L., Erd˝ os A., Hajt´ os I., Lutz H., Hofmann-Lehmann R. Molecular characterization of two different strains of haemotropic mycoplasmas from a sheep flock with fatal haemolytic anaemia, concomitant Anaplasma ovis infection // Veterinary Microbiology. 2008; 136 (3-4): 372-377. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2008.10.031

12. Kessler R. H., Ristic M. In vitro cultivation of Anaplasma marginale: invasion of and development in noninfected erythrocytes // American Journal of Veterinary Research. 1979; 40 (12): 1774-1776.

13. Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F., Garcia-Garcia J. C. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances in defining host-pathogen adaptations of a tick-borne rickettsia // Parasitology. 2004; 129: 285-300. https://doi.org/10.1017/s0031182003004700

14. Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F., Coetzee J. F., Ewing S. A. The natural history of Anaplasma marginale // Veterinary Parasitology. 2010; 167 (2-4): 95-107. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2009.09.012

15. Köseoğlu A. E., Can H., Güvendi M., Erkunt Alak S., Değirmenci Döşkaya A., Karakavuk M., Döşkaya M., Ün C. Molecular characterization of Anaplasma ovis Msp4 protein in strains isolated from ticks in Turkey: A multi-epitope synthetic vaccine antigen design against Anaplasma ovis using immunoinformatic tools // Biologicals. 2024; 85: 101749. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2024.101749

16. Kuttler K. L. Anaplasma infections in wild and domestic ruminants: a review // Journal of Wildlife Diseases. 1984; 20 (1): 12-20. https://doi.org/10.7589/0090-3558-20.1.12

17. Li Y., Li J., Xieripu G., Rizk M.A., Macalanda A. M. C., Gan L., Ren J., Mohanta U. K., El-Sayed S. A. E., Chahan B., Xuan X., Guo Q. Molecular Detection of Theileria ovis, Anaplasma ovis, and Rickettsia spp. in Rhipicephalus turanicus and Hyalomma anatolicum Collected from Sheep in Southern Xinjiang, China // Pathogens. 2024; 13 (8): 680. https://doi.org/10.3390/pathogens13080680

18. Mukhtar M. U., Iqbal N., Yang J., Niu Q., Zhao S., Li Z., Zhao Y., Rashid M., Chen Z., Guan G., Liu Z., Yin H. Identification and evaluation of UL36 protein from Dermacentor silvarum salivary gland and its interaction with Anaplasma ovis VirB10 // Parasites & Vectors. 2020; 13 (1): 105. https://doi.org/10.1186/s13071-020-3975-9

19. Munderloh U. G., Blouin E. F., Kocan K. M., Ge N. L., Edwards W. L., Kurtti T. J. Establishment of the tick (Acari: Ixodidae)-borne cattle pathogen Anaplasma marginale (Rickettsiales:Anaplasmataceae) in tick cell culture. Journal of Medical Entomology. 1996; 33 (4): 656-64. https://doi.org/10.1093/jmedent/33.4.656

20. Ndung'u L. W., Aguirre C., Rurangirwa F. R., McElwain T. F., McGuire T. C., Knowles D. P., Palmer G. H. Detection of Anaplasma ovis infection in goats by major surface protein 5 competitive inhibition enzyme-linked immunosorbent assay // Journal of Clinical Microbiology. 1995; 33 (3): 675- 679. https://doi.org/10.1128/jcm.33.3.675-679.1995

21. Ruiz H., de Arcaute M. R., Benito A. Á., Villanueva-Saz S., Jiménez J. C., Lacasta D. Long-lasting infection with Anaplasma ovis in sheep // Veterinary Research Communications. 2024; 48 (1): 521-525. https://doi.org/10.1007/s11259-023-10186-y

22. Silaghi C., Santos A. S., Gomes J., Christova I., Matei I. A., Walder G., Domingos A., Bell-Sakyi L., Sprong H., von Loewenich F. D., Oteo J. A., de la Fuente J., Dumler J. S. Guidelines for the Direct Detection of Anaplasma spp. in Diagnosis and Epidemiological Studies // Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 2017; 17 (1): 12-22. https://doi.org/10.1089/vbz.2016.1960

23. Taqadus A., Chiou C. C., Amaro-Estrada I., Asif M., Nasreen N., Ahmad G., Iqbal J., Ali M., Khan A., Iqbal F., Chen C. C. Epidemiology and Phylogeny of Anaplasma ovis with a Note on Hematological and Biochemical Changes in Asymptomatic Goats Enrolled from Four Districts in Punjab, Pakistan. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 2023; 23 (10): 495-506. https://doi.org/10.1089/vbz.2023.0017

24. Waghela S. D., Cruz D., Droleskey R. E., DeLoach J. R., Wagner G. G. In vitro cultivation of Anaplasma marginale in bovine erythrocytes co-cultured with endothelial cells // Veterinary Parasitology. 1997; 73 (1-2): 43-52. https://doi.org/10.1016/s0304-4017(97)00045-9

25. Waghela S. D., Melendy D., Cruz D., Wagner G. G. Antigenic analysis of Anaplasma marginale grown in bovine erythrocytes co-cultured with bovine endothelial cells // Veterinary Parasitology. 2000; 94 (1-2): 133-139. https://doi.org/10.1016/s0304-4017(00)00375-7

26. Wei R., Liu H. B., Jongejan F., Jiang B. G., Chang Q. C., Fu X., Jiang J. F., Jia N., Cao W. C. Cultivation of Anaplasma ovis in the HL-60 human promyelocytic leukemia cell line // Emerging Microbes & Infections. 2017; 6 (9): e83. https://doi.org/10.1038/emi.2017.70