Выявление генотипа паразитических нематод Teladorsagia circumcincta, резистентного к антигельминтным препаратам бензимидазольного ряда

Цель исследований – выявление резистентных к антигельминтным препаратам бензимидазольного ряда штаммов паразитических нематод Teladorsagia circumcincta молекулярно-генетическими методами.

Материалы и методы. Животные: овцы породы «Южная мясная» возрастом от 8 до 12 мес. Паразитические нематоды сем. Trichostrongylidae были получены из сычугов овец. Самцов и самок нематод сохраняли в отдельных промаркированных пробирках типа «Эппендорф» при -20 ^оС. Молекулярно-генетические исследования. Выделение нативной геномной ДНК проводили с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК из микроколичеств тканей "ДНК-Экстран-2" («Синтол», Москва). Проведение «вложенной ПЦР». Для амплификации ДНК использовали термоциклер T-100 Bio-Rad и коммерческий набор реактивов Master Mix, Евроген.  Полученные фрагменты ДНК использовали в качестве основного компонента для проведения реакции рестрикции с эндонуклеазой RsaI («Сибэнзим», г. Новосибирск). Выявление резистентного генотипа T. circumcincta методом ПЦР. Мультиплексную ПЦР проводили в соответствии с рекомендациями Silvestre et al, 2000 с использованием коммерческого набора реактивов Master Mix, Евроген. Результаты электрофореза анализировали в гель-документирующей системе GelDoc, Bio-Rad. Секвенирование полученных фрагментов проводили в компании ЦКП «Геном» ФГБНУ «МГНЦ» (Москва).

Результаты и обсуждение. Для выявления мутаций в гене β-тубулина, приводящих к формированию резистентности у паразитических нематод вида T. circumcincta к антигельминтным препаратам бензимидазольного ряда, были проведены молекулярно-генетические исследования с использованием методов «вложенной» ПЦР, анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и «мультиплексной» ПЦР. Результаты наличия нуклеотидных замен в гене β-тубулина были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

1. Пименов И. А., Одоевская И. М., Плиева А. М., Варламова А. И. Возможности использования «вложенной» ПЦР-ПДРФ для таксономиче ской идентификации личинок L3 семейства Trichostrongylidae, Leiper, 1912 // Российский паразитологический журнал. 2024. Т. 18. № 3. С. 264–273. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2024-18-3-264-273

2. Пименов И. А., Варламова А. И., Афанасьев А. Д., Одоевская И. М. Анализ наличия резистентности у паразитических нематод Haemonchus contortus к антигельминтным препаратам бензимидазольного ряда методом гнездовой изо термической амплификации (ПЦР) // Российский паразитологический журнал. 2024. Т. 18. № 2. С. 170–178. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2024-18-2-170-178

3. Avramenko R. W., Redman E. M., Windeyer C., Gilleard J. S. Assessing anthelmintic resistance risk in the post-genomic era: a proof-of-concept study assessing the potential for widespread benzimidazole-resistant gastrointestinal nematodes in North American cattle and bison. Parasitology. 2020; 147. 897–906. https://doi.org/10.1017/S0031182020000426

4. Coles G. C., Jackson F., Pomroy W. E., Prichard R. K., von Samson-Himmelstjerna G., Silvestre A., Taylor M. A., Vercruysse J. The detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology. 2006; 136 (3-4):167-185. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2005.11.019

5. Hinney B., Wiedermann S., Bosco A., Rinaldi L., Hofer M., Joachim A., Krücken J., Steinborn R. Development of a three-color digital PCR for early and quantitative detection of benzimidazole resistance-associated single nucleotide polymorphisms in Haemonchus contortus. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2023; 22. 88-95. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2023.06.001

6. Kaplan R. M. Biology, epidemiology, diagnosis, and management of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of livestock. Veterinary Clinics: Food Animal Practice. 2020; 36 (1): 17–30. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2019.12.001

7. Kaplan R. M., Denwood M. J., Nielsen M. K., T hamsborg S. M., Torgerson P. R., Gilleard J. S., Dobson R. J., Vercruysse J., Levecke B. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) guideline for diagnosing anthelmintic resistance using the faecal egg count reduction test in ruminants, horses and swine. Veterinary Parasitology. 2023; 318. 109936. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2023.109936

8. Ng’etich A. I., Amoah I. D., Bux F. et al. Anthelmintic resistance in soil-transmitted helminths: One Health considerations. Parasitology Research. 2024; 123. 62. https://doi.org/10.1007/s00436-023-08088-8

9. Rajagopal A., Sabu L., Radhika R., Devada K., Jain Jose K., Thomas N., Aravindakshan T. V. Development of PCR-RFLP for the detection of benzimidazole resistance polymorphisms in isotype 1 β-tubulin gene of Trichostrongylus colubriformis. Small Ruminant Research. 2023; 222. 106954. https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2023.106954.

10. Santos J. M. L., Vasconcelos J. F., Frota G. A., Freitas E. P., Teixeira M., Vieira L. S., Bevilaqua C. M. L., Monteiro J. P. Quantitative molecular diagnosis of levamisole resistance in populations of Haemonchus contortus. Experimental Parasitology. 2019; 205. 107734. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2019.107734

11. Silvestre A., Humbert J.-F. A Molecular Tool for Species Identification and Benzimidazole Resistance Diagnosis in Larval Communities of Small Ruminant Parasites. Experimental Parasitology. 2000; 95 (4): 271–276. https://doi.org/10.1006/expr.2000.4542

12. Van Wyk J. A., Mayhew E. Morphological identification of parasitic nematode infective larvae of small ruminants and cattle: A practical lab guide. Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 2013; 80 (1). 539. https://doi.org//10.4102/ojvr.v80i1.539

13. Zajac A. M., Garza J. Biology, Epidemiology, and Control of Gastrointestinal Nematodes of Small Ruminants. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2020; 36 (1): 73-87. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2019.12.005

14. Zarlenga D. S., Barry Chute M., Gasbarre L. C., Boyd P. C. A multiplex PCR assay for differentiating economically important gastrointestinal nematodes of cattle. Veterinary Parasitology. 2001; 97 (3): 199-209. https://doi.org/10.1016/s0304-4017(01)00410-1