Анализ наличия резистентности у паразитических нематод Haemonchus contortus к антигельминтным препаратам бензимидазольного ряда методом гнездовой изотермической амплификации (ПЦР)

Цель исследования – провести мониторинг фермерских хозяйств, расположенных на территории Европейской части РФ, на предмет выявления резистентности к воздействию антигельминтных препаратов из группы бензимидазолов в популяциях нематод Haemonchus contortus, паразитирующих в желудочно-кишечном тракте у мелкого рогатого скота.

Материалы и методы. Исследования проводили в 2023–2024 гг. на убойных пунктах, расположенных в Московской области. На первом этапе была проведена таксономическая идентификация паразитических нематод и личинок (L3), определена видовая принадлежность стронгилят от овец. Материалом для исследования служили сычуги с фрагментами 12-перстной кишки и дистальный фрагмент прямой кишки с содержащимися в ней фекалиями. Для молекулярных исследований были использованы половозрелые нематоды и личинки L3 H. contortus, выделенные из сычугов и фекалий мелкого рогатого скота, привезённого на убойные пункты в Московской области из 8 регионов Европейской части РФ – Московской, Астраханской, Орловской, Липецкой, Тульской, Брянской областей, Ставрополья и Дагестана. Исследования проводили на базе лаборатории молекулярной биологии Всероссийского НИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений – фил. ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН. Проведена статистическая обработка полученных данных, определены средние показатели заражённости паразитическими нематодами (ИИ и ЭИ). Было исследовано 56 проб ДНК нематод H. contortus методом гнездовой изотермической амплификации (ПЦР) на предмет выявления наличия аллелей генов, определяющих наличие резистентности к препаратам из группы бензимидазолов.

Результаты и обсуждение. При проведении молекулярно-генетических исследований ДНК H. contortus, отобранных от овец, прибывших из разных регионов, гомозиготные особи (100%), резистентные к бензимидазолу, были обнаружены только в популяции паразитических нематод из Орловской области. В остальных областях были выявлены только гомозиготные и гетерозиготные особи, восприимчивые к бензимидазолу.

1. Пименов И. А., Кузнецов Д. Н., Одоевская И. М., Афанасьев А. Д., Варламова А. И., Архипов И. А. К фауне нематод пищеварительного тракта овец в Европейской части России // Российский паразитологический журнал. 2023. Т. 17. № 2. С. 206–213. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2023-17-2-206-213

2. Avramenko R. W., Redman E. M., Windeyer C., Gilleard J. S. Assessing anthelmintic resistance risk in the post-genomic era: a proof-of-concept study assessing the potential for widespread benzimidazole-resistant gastrointestinal nematodes in North American cattle and bison. Parasitology. 2020; 147 (8): 897–906. https://doi.org/10.1017/S0031182020000426

3. Baltrušis A., Claude L., Halvarsson P., Mikko S., Höglund J. Using droplet digital PCR for the detection of hco-acr-8b levamisole resistance marker in H. contortus. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2021; 15. 168-176. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2021.03.002

4. Baltrušis A., Halvarsson P., Höglund J. Exploring benzimidazole resistance in Haemonchus contortus by next generation sequencing and droplet digital PCR. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2018; 8 (3): 411-419. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2018.09.003

5. Charlier J., Rinaldi L., Musella V., Ploeger H. W., Chartier C., Vineer H. R., Hinney B., Samson-Himmelstjerna G., Ba ̆cescu B., Mickiewicz M. Initial assessment of the economic burden of major parasitic helminth infections to the ruminant livestock industry in Europe. Prev. Vet. Med. 2020; 182. 105103. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2020.105103

6. Dilks C. M., Hahnel S. R., Sheng Q., Long L., McGrath P. T., Andersen E. C. Quantitative benzimidazole resistance and fitness effects of parasitic nematode beta- tubulin alleles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2020; 14. 28–36. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.08.003

7. Dobson R. J., Hosking B. C., Jacobson C. L., Cotter J. L., Besier R. B., Stein P. A., Reid S. A. Preserving new anthelmintics: a simple method for estimating faecal egg count reduction test (FECRT) confidence limits when efficacy and/or nematode aggregation is high. Vet. Parasitol. 2012; 186. 79–92. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2011.11.049

8. Hinney B., Wiedermann S., Bosco A., Rinaldi L., Hofer M., Joachim A., Krücken J., Steinborn R. Development of a three-colour digital PCR for early and quantitative detection of benzimidazole resistance-associated single nucleotide polymorphisms in Haemonchus contortus. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2023; 22. 88-95. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2023.06.001

9. Höglund J., Gustafsson K., Ljungström B. L., Engström A., Donnan A., Skuce P. Anthelmintic resistance in Swedish sheep flocks based on a comparison of the results from the faecal egg count reduction test and resistant allele frequencies of the β-tubulin gene. Veterinary Parasitology. 2009; 161 (1–2): 60-68. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2008.12.001

10. Kaplan R. M. Biology, epidemiology, diagnosis, and management of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of livestock. Veterinary Clinics: Food Animal Practice. 2020; 36 (1): 17–30. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2019.12.001

11. Kaplan R. M., Vidyashankar A. N. An inconvenient truth: global warming and anthelmintic resistance. Veterinary Parasitology. 2012; 186. 70–78. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2011.11.048

12. Kaplan R. M., Denwood M. J., Nielsen M. K., Thamsborg S. M., Torgerson P. R., Gilleard J. S., Dobson R. J., Vercruysse J., Levecke B. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) guideline for diagnosing anthelmintic resistance using the faecal egg count reduction test in ruminants, horses and swine. Veterinary Parasitology. 2023; 318. 109936. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2023.109936

13. Königová A., Urda Dolinská M., Babják M. et al. Experimental evidence for the lack of sensitivity of in vivo faecal egg count reduction testing for the detection of early development of benzimidazole resistance. Parasitol. Res. 2021; 120. 153–159. https://doi.org/10.1007/s00436-020-06965-0

14. Kotze A. C., Gilleard J. S., Doyle S. R., Prichard R. K. Challenges and opportunities for the adoption of molecular diagnostics for anthelmintic resistance. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2020; 14. 264–273. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.11.005

15. Kotze A. C., Prichard R. Anthelmintic resistance in Haemonchus contortus: history, mechanisms and diagnosis. Adv. Parasitol. 2016; 93. 397–428. https://doi.org/10.1016/bs.apar.2016.02.012

16. Levecke B., Kaplan R. M., Thamsborg S. M., Torgerson P. R., Vercruysse J., Dobson R. J. How to improve the standardization and the diagnostic performance of the fecal egg count reduction test? Veterinary Parasitology. 2018; 253. 71–78. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2018.02.004

17. Melville L. A., Redman E., Morrison A. A., Chen P. C. R., Avramenko R., Mitchell S., Van Dijk J., Innocent G., Sargison F., Aitken C. Large scale screening for benzimidazole resistance mutations in Nematodirus battus, using both pyrosequence genotyping and deep amplicon sequencing, indicates the early emergence of resistance on UK sheep farms. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2020; 12. 68–76. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.03.001

18. Morgan E. R., Lanusse C., Rinaldi L., Charlier J., Vercruysse J. Confounding factors affecting faecal egg count reduction as a measure of anthelmintic efficacy. Parasite. 2022; 29. 20. https://doi.org/10.1051/parasite/2022017

19. Umer C., Redman E. M., Kaplan R., Yazwinski T., Sargison N., Gilleard J. S. Contrasting patterns of isotype-1 β-tubulin allelic diversity in Haemonchus contortus and Haemonchus placei in the southern USA are consistent with a model of localized emergence of benzimidazole resistance. Veterinary Parasitology. 2020; 286. 109240. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2020.109240

20. Vineer H. R., Morgan E. R., Hertzberg H., Bartley D. J., Bosco A., Charlier J., Chartier C., Claerebout E., De Waal T., Hendrickx G. Increasing importance of anthelmintic resistance in European livestock: creation and meta-analysis of an open database. Parasite. 2020; 27. 69. https://doi.org/10.1051/parasite/2020062

21. Wolstenholme A. J., Fairweather I., Prichard R., Samson-Himmelstjerna G. von, Sangster N. C. Drug resistance in veterinary helminths. Trends in Parasitology. 2004; 20 (10): 469–476. https://doi.org/10.1016/j.pt.2004.07.010