Диагностика анаплазмоза крупного рогатого скота методом ПЦР в реальном времени

Цель исследования: разработка метода ПЦР в реальном времени для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота. Материалы и методы. Для разработки праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР в реальном времени были использованы имеющиеся в базе данных Генбанк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) последовательности гена msp1α 57 изолятов Anaplasma marginale. Выявление консервативных участков гена msp1α проводили с помощью программы Сlustal Omega (https:// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Cпецифичность праймеров и зонда была проверена in silico с использованием программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) экспериментально на образцах крови животных, инфицированных анаплазмами A. ovis, A. centrale, A. bovis, A. phagocytophilum и A. platys, и секвенированием ампликонов методом Сэнгера. Для оценки чувствительности метода была использована сконструированная нами плазмида pGEM-msp1α, содержащая фрагмент гена msp1α длиной 207 п.н. Результаты и обсуждение. Разработан метод ПЦР в реальном времени для выявления возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота A. marginale. Были разработаны праймеры и флуоресцентно-меченый зонд для амплификации и детекции фрагмента гена msp1а длиной 207 п.н. и оптимизированы условия ПЦР. Чувствительность метода позволяет выявлять одну копию гена msp1а А. marginale в анализируемом образце ДНК. Специфичность метода позволяет дифференцировать A. marginale от других видов анаплазм (A. ovis, A. bovis, A. centrale, A. phagocytophilum, A. platys). Разработанный метод может быть использован для обнаружения и количественной оценки А. marginale в образцах крови инфицированных животных с целью подтверждения диагноза, а также при проведении эпизоотологического мониторинга анаплазмоза крупного рогатого скота.

крупный рогатый скот, анаплазмоз, Anaplasma marginale, ПЦР в реальном времени, cattle, anaplasmosis, Anaplasma marginale, PCR in real time mode

1. Георгиу Х., Белименко В. В. Анаплазмоз крупного рогатого скота // Рос. вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. 2015. № 1. С. 5-7

2. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) // Рос. вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013. № 2. С. 36-40

3. Казаков Н. А., Идина М. Ф. Анаплазмоз крупного рогатого скота в Тверской области // Ветеринарная патология. 2009. № 2. С. 72-75

4. Казакова Е. В., Ясюкевич В. В., Попов И. О., Семенов С. М. Распространение клещей Ixodes ricinus L., 1758 и Ixodes persulcatus Shulze, 1930 (Parasitiformes, Ixodidae) на территории России и соседних стран и наблюдаемые изменения климата // Доклады Академии наук. 2009. № 5. С. 688-692

5. Ковальчук С. Н., Бабий А. В., Архипова А. Л., Архипов А. В. Косовский Г. Ю. Оценка уровня паразитемии методом ПЦРвреальном времени при анаплазмозе крупного рогатого скота // Проблемы биологии продуктивных животных. 2016. № 3. С. 98-105

6. Либерман Е. Л., Хлызова Т. А. Зависимость инвазирования крупного рогатого скота анаплазмозом от численности насекомых комплекса «Гнус» // Educatio. 2015. № 3. С. 46-50

7. Мальцева О. Е. Анаплазмоз крупного рогатого скота в Центральном регионе РФ (эпизоотология, вакцинопрофилактика, химиотерапия и меры борьбы): автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2004. 15 с

8. Минасян В. Г., Ткаченко Ю. Г., Идина М. Ф. Методы лечения коров больных анаплазмозом // Ветеринарная патология. 2009. № 4. С. 82-85

9. Самуйленко А. Я., Гулюкин М. И., Василевич Ф. И., Ковальчук С. Н., Глазко Т. Т., Бабий А. В., Архипов А. В., Косовский Г. Ю. ДНК-диагностика анаплазмоза крупного рогатого скота // Российский паразитологический журнал. 2015. № 4. С. 72-78

10. Bilgiç H. B., Karagenç T., Simuunza M., Shiels B., Tait A., Eren H., Weir. W. Development of multiplex PCR assay for simultaneous detection of Theileria annulata, Babesia bovis and Anaplasma marginale in cattle // Exp. Parasitol. 2013. № 133(2). Р. 222-229

11. Brayton K. A., Kappmeyer L. S., Herndon D. R., Dark M. J., Tibbals D. L., Palmer G. H., McGuire T. C., Knowles D. P. Jr. Complete genome sequencing of Anaplasma marginale reveals that the surface is skewed to two superfamilies of outer membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sc.i U S A. 2005. № 102. Р. 844-849

12. CarelliG.,DecaroN.,LorussoA.,EliaG.,LorussoE., Mari V., Ceci L., Buonavoglia C. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR // Vet. Microbiol. 2007. Vol. 124. P. 107-114

13. de la Fuente J., Massung R. F., Wong S. J., Chu F. K., Lutz H., Meli M. et al. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 1309- 1317

14. Decaro N., Carelli G., Lorusso E., Lucente M. S., Greco G., Lorusso A., Radogna A., Ceci L., Buonavoglia C. Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale // J. Vet. Diagn. Invest. 2008. Vol. 20. 606-611

15. Dreher U. M., Fuente J., Hofmann-Lehmann R., Meli M. L., Pusterla N., Kocan K. M., Woldehiwet Z., Braun U., Regula G., Staerk K. D., Lutz H. Serologic crossreactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. № 12. Р. 1177- 1183

16. Inokuma H., Raoult D., Brouqui P. Detection of Ehrlichia platys DNA in brown dog ticks (Rhipicephalus sanguineus) in Okinawa Island, Japan // J. Clin. Microbiol. 2000. № 38. С. 4219- 4221

17. KawaharaM.,RikihisaY.,LinQ.,IsogaiE.,TaharaK., Itagaki A., Hiramitsu Y., Tajima T. Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma bovis, Anaplasma centrale, and a novel Ehrlichia sp. in wild deer and ticks on two major islands in Japan // Appl. Environ. Microbiol. 2006. № 72. Р. 1102-1109

18. Kivaria F. M. Estimated direct economic costs associated with tick-borne diseases on cattle in Tanzania // Trop. Anim. Health Prod. 2006. V. 38. P. 291-299

19. Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F., Coetzee J. F., Ewing S. A. The natural history of Anaplasma marginale // Veterinary parasitology. 2010. V. 167. P. 95-107

20. Kocan K. M., J. de la Fuente J., Guglielmone A. A., Melendez R. D. Antigens and alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle // Clin. Microbiol. Rev. 2003. V. 16. Р. 698- 712

21. Löhr C. V., Rurangirwa F. R., McElwain T. F., Stiller D., Palmer G. H. Specific expression of Anaplasma marginale major surface protein 2 salivary gland variants occurs in the midgut and is an early event during tick transmission // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 114-120

22. Picoloto G., Lima R. F., Olegário L. A., Carvalho C. M., Lacerda A. C., Tomás W. M., Borges P. A., Pellegrin A. O., Madruga C. R. Real-time polymerase chain reaction to diagnose Anaplasma marginale in cattle and deer (Ozotoceros bezoarticus leucogaster) of the Brazilian Pantanal // Rev. Bras. Parasitol. Vet. 2010.Vol. 19. P. 186-188

23. Reinbold J. B., Coetzee J. F., Sirigireddy K. R., Ganta R. R. Detection of Anaplasma marginale and A.phagocytophilum in bovine peripheral blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay // J. Clin. Microbiol. 2010. Vol 48. P. 2424-2432

24. Strik N. I., Alleman A. R., Barbet A. F., Sorenson H. L., Wamsley H. L., Gaschen F. P., Luckschander N., Wong S., Chu F., Foley J. E., Bjoersdorff A., Stuen S., Knowles D. P. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale // Clin. Vaccine. Immunol. 2007. V. 14. P. 262-268

25. Torina A., Agnone A., Blanda V., Alongi A., D’Agostino R., Caracappa S., Marino A. M., Di Marco V., de la Fuente J. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale // Ticks Tick Borne. Dis. 2012. V. 3. P. 283-287

26. Wall D. T. Anaplasmosis control and diagnosis in South Africa // Ann N Y Acad Sci. 2000. № 916. P. 474-83

27. Ybañez A. P., Sivakumar T., Ybañez R. H. D., Ratilla J. C., Perez Z. O., Gabotero S. R., Hakimi H., Kawazu S., Matsumoto K., Yokoyama N., Inokuma H. First molecular characterization of Anaplasma marginale in cattle and Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks in Cebu, Philippines // J. Vet. Med. Sci. 2013. V. 75. P. 27-36