Возможности использования «вложенной» ПЦР-ПДРФ для таксономической идентификации личинок L3 семейства Trichostrongylidae, Leiper, 1912

Цель исследования – применить молекулярно-генетические методы исследований для выявления таксономической принадлежности паразитических нематод желудочно-кишечного тракта овец сем. Trichostrongylidae, используя «вложенную» ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Материалы и методы. Паразитические нематоды: личинки стронгилят L3, полученные в результате инкубирования проб фекалий овец. Выделение геномной ДНК проводили с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК из микроколичеств тканей (фирма «Синтол», Москва), согласно рекомендациям производителя. Для амплификации ДНК использовали термоциклер T-100 Bio-Rad и коммерческий набор реактивов Master Mix, Евроген. Режим проведения ПЦР осуществляли согласно руководству WAAVP, 2006. Реакцию рестрикции эндонуклеазой RsaI амплифицированных фрагментов трихостронгилид проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя фермента («Сибэнзим», г. Новосибирск).
Результаты и обсуждение. Для определения таксономической принадлежности личинок стронгилят, выделенных после инкубации фекалий, полученных от овец, были проведены молекулярно-генетические исследования методом «вложенной» ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Данный метод дает возможность с наименьшими трудозатратами идентифицировать генотипы трех видов стронгилят: Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis, Teladorsagia circumcincta на стадии личинки.

1. Ивашкин В. М., Орипов А. О., Сонин М. Д. Определитель гельминтов мелкого рогатого скота. М.: Наука, 1989. 255 с.

2. Никитин В. Ф., Павласек И. Aвторское свидетельство CCCР № 1095908, кп. A 61 В 10/10, 1981. SU 1 391 625 A1

3. Пименов И. А., Кузнецов Д. Н., Одоевская И. М., Афанасьев А. Д., Варламова А. И., Архипов И. А. К фауне нематод пищеварительного тракта овец в Европейской части России // Российский паразитологический журнал. 2023. Т. 17. № 2. С. 206–213. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2023-17-2-206-213

4. Álvarez-Sánchez M. A., Pérez-García J., Cruz-Rojo M. A., Rojo-Vázquez F. A. Real time PCR for the diagnosis of benzimidazole resistance in trichostrongylids of sheep. Veterinary Parasitology. 2005; 129 (3–4): 291-298. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2005.02.004

5. Baltrušis A., Claude L. Halvarsson P., Mikko S., Höglund J. Using droplet digital PCR for the detection of hco-acr-8b levamisole resistance marker in H. contortus. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2021; 15. 168-176. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2021.03.002

6. Baltrušis A., Halvarsson P., Höglund J. Exploring benzimidazole resistance in Haemonchus contortus by next generation sequencing and droplet digital PCR. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2018; 8 (3): 411-419. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2018.09.003

7. Charlier J., Rinaldi L., Musella V., Ploeger H. W., Chartier C., Vineer H. R., Hinney B., Samson-Himmelstjerna G., Ba ̆cescu B., Mickiewicz M. Initial assessment of the economic burden of major parasitic helminth infections to the ruminant livestock industry in Europe. Preventive Veterinary Medicine. 2020; 182. 105103. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2020.105103

8. Coles G. C., Jackson F., Pomroy W. E., Prichard R. K., von Samson-Himmelstjerna G., Silvestre A., Taylor M. A., Vercruysse J. The detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology. 2006; 31; 136 (3-4): 167-185. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2005.11.019

9. Dilks C. M., Hahnel S. R., Sheng Q., Long L., McGrath P. T., Andersen E. C. Quantitative benzimidazole resistance and fitness effects of parasitic nematode beta- tubulin alleles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2020; 14. 28–36. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.08.003

10. Dobson R. J., Hosking B. C., Jacobson C. L., Cotter J. L., Besier R. B., Stein P. A., Reid S. A. Preserving new anthelmintics: a simple method for estimating faecal egg count reduction test (FECRT) confidence limits when efficacy and/or nematode aggregation is high. Veterinary Parasitology. 2012; 186. 79–92. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2011.11.049

11. Gasser R. B. PCR-based technology in veterinary parasitology. Veterinary Parasitology. 1999. 84. 229–258. https://doi.org/10.1016/s0304-4017(99)00036-9

12. Hinney B., Wiedermann S., Bosco A., Rinaldi L., Hofer M., Joachim A., Krücken J., Steinborn R. Development of a three-colour digital PCR for early and quantitative detection of benzimidazole resistance-associated single nucleotide polymorphisms in Haemonchus contortus. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2023; 22. 88-95. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2023.06.001

13. Humbert J. F., Elard L. A simple PCR method for rapidly detecting defined point mutations. Journal: Technical Tips Online. 1997; ISSN: 1366-2120.

14. Kaplan R. M. Biology, epidemiology, diagnosis, and management of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of livestock. Veterinary Clinics: Food Animal Practice. 2020; 36 (1): 17–30. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2019.12.001

15. Kaplan R. M., Denwood M. J., Nielsen M. K., Thamsborg S. M., Torgerson P. R., Gilleard J. S., Dobson R. J., Vercruysse J., Levecke B. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) guideline for diagnosing anthelmintic resistance using the faecal egg count reduction test in ruminants, horses and swine. Veterinary Parasitology. 2023; 318. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2023.109936

16. Kotze A. C., Gilleard J. S., Doyle S. R., Prichard R. K. Challenges and opportunities for the adoption of molecular diagnostics for anthelmintic resistance. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 2020; 14. 264–273. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.11.005

17. Kotze A. C., Prichard R. Anthelmintic resistance in Haemonchus contortus: history, mechanisms and diagnosis. Advances in Parasitology. 2016; 93. 397–428. https://doi.org/10.1016/bs.apar.2016.02.012

18. Lancaster M. B., Hong C. Differentiation of third stage larvae of “ovine Ostertagia” type and Trichostrongylus species. The Veterinary Record. 1987; 120. 503. http://doi.org/10.1136/vr.120.21.503, PMid:3604011

19. O’Callaghan M. G. Observations on the sheath extension of the third stage, infective larvae of Trichostrongylus rugatus. Veterinary Parasitology. 2004; 126. 397–402. http://doi.org/10.1016/j.vetpar.2004.07.027

20. Prichard R. Application of molecular biology in veterinary parasitology. Veterinary Parasitology. 1997; 71. 155–175. https://doi.org/10.1016/s0304-4017(97)00029-0

21. Rajagopal A., Sabu L., Radhika R., Devada K., Jain Jose K., Thomas N., Aravindakshan T. V. Development of PCR-RFLP for the detection of benzimidazole resistance polymorphisms in isotype 1 β-tubulin gene of Trichostrongylus colubriformis. Small Ruminant Research. 2023. 222. 106954. https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2023.106954.

22. Rossanigo C. E., Gruner L. The length of strongylid nematode infective larvae as a reflection of developmental conditions in faeces and consequence on their viability. Parasitology Research. 1996; 82. 304–311. http://doi.org/10.1007/s004360050118, PMid:8740545

23. Santos J. M. L., Vasconcelos J. F., Frota G. A., Freitas E. P., Teixeira M., Vieira L. S., Bevilaqua C. M. L., Monteiro J. P. Quantitative molecular diagnosis of levamisole resistance in populations of Haemonchus contortus. Experimental Parasitology. 2019; 205. 107734. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2019.107734

24. Silvestre A., Humbert J.-F. A Molecular Tool for Species Identification and Benzimidazole Resistance Diagnosis in Larval Communities of Small Ruminant Parasites. Experimental Parasitology. 2000; 95 (4): 271–276. https://doi.org/10.1006/expr.2000.4542

25. Smits H. L., Hartskeerl R. A. PCR amplification reactions in parasitology. Journal of Microbiological Methods. 1995; 23. 41–54.

26. Van Wyk J. A., Cabaret J., Michael L. M. Morphological identification of nematodes of small ruminants and cattle simplified. Veterinary Parasitology. 2004; 119. 277–306. http://doi.org/10.1016/j.vetpar.2003.11.012

27. Van Wyk J. A., Mayhew E. Morphological identification of parasitic nematode infective larvae of small ruminants and cattle: A practical lab guide. Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 2013; 80 (1): 14. http://doi.org/10.4102/ojvr.v80i1.539

28. Weiss J. B. DNA probes and PCR for diagnosis of parasitic infections. Clinical Microbiology Reviews. 1995; 8. 113–130. https://doi.org/10.1128/CMR.8.1.113