Анализ таксономической принадлежности ASV (Amplicon Sequence Variant) представителей Cryptosporidium scrofarum у свиней в условиях Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ

Цель исследований – выделение, идентификация и анализ типов ASV (Amplicon Sequence Variant) криптоспоридий свиней в условиях Вологодской области РФ.

Материалы и методы. Исследования в Российской Федерации выполнены впервые. Исследования проводили в свиноводческих хозяйствах на территории Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ в период с января по октябрь 2023 г. Фекалии получали от поросят различных возрастов, а также от подсосных свиноматок. Пробы исследовали с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Идентификацию видов рода Cryptosporidium в пробах фекалий проводили с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликонных библиотек фрагментов гена 18S рРНК, полученных в результате проведения nested (вложенной) ПЦР с последующим «деноизингом», объединением последовательностей, восстановления исходных филотипов (ASV, (Amplicon Sequence Variant)).

Результаты и обсуждение. Представители рода Cryptosporidium были выявлены в каждой исследуемой возрастной группе. В результате высокопроизводительного секвенирования библиотек по технологии Illumina для каждого образца было получено от 20 до 100 тыс. нуклеотидных последовательностей (прочтений), после обработки которых суммарно было выявлено 2372 ASV. Анализ таксономической принадлежности ASV, проведённый с помощью филогенетического анализа, дополненного анализом с использованием алгоритма blastn в базе данных GenBank, показал, что суммарно во всех исследованных образцах присутствуют только 10 ASV, имеющих высокое сходство с последовательностями, депонированными в GenBank как фрагменты гена 18S рРНК Cryptosporidium scrofarum. 8 типов ASV являются уникальными и не повторяются от хозяйства к хозяйству. Вероятно, эти последовательности принадлежат местным популяциям подвидов C. scrofarum. Интересным представляется обнаружение уникальной последовательности рода Cryptosporidium типа ASV8, сходство которого с ближайшим родственником рода составляет всего 91,47%, что может свидетельствовать о довольно удалённом таксономическом родстве. Данный тип нуклеотидной последовательности в дальнейшем может быть описан как новый вид. Все выявленные уникальные нуклеотидные последовательности ASV были депонированы в GenBank.

1. Горбов Ю. К., Мачинский А. П. Распространение ассоциативных заболеваний сельскохозяйственных животных и опыт борьбы с ними в Мордовской АССР // Паразитоценозы и ассоциативные болезни. М., 1984. С. 235-252.

2. Кряжев А. Л., Новиков А. С. Идентификация таксономической принадлежности криптоспоридий у поросят в условиях северо-запада РФ при помощи молекулярно-генетических методов // Российский паразитологический журнал. 2023. Т. 17. № 1. С. 84–90. https://doi.org/10.31016/1998-8435-202317-1-84-90

3. Кряжев А. Л., Новиков А. С., Никитин В. Ф. Эпизоотологическая ситуация по криптоспоридиозу поросят в промышленном свиноводстве Вологодской области // Ветеринария. 2020. № 1. С. 30-34. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2020.23.1.30-34

4. Новиков А. С., Кряжев А. Л. Криптоспоридиоз поросят в условиях северо-западного Нечерноземья РФ. Монография. Вологда–Молочное: Вологодская ГМХА, 2022. 112 с.

5. Callahan B. J., McMurdie P. J., Rosen M. J., Han A. W., Johnson A. J. A., & Dada S. H. High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. 2016; 13: 581-583. https://doi.org/10.1038/nmeth.3869

6. Chen Y., Qin H., Wu Y., Xu H., Huang J., Li J., & Zhang L. Global prevalence of Cryptosporidium spp. in pigs: a systematic review and meta-analysis. Parasitology. 2023; С. 1-38. https://doi.org/10.1017/S0031182023000276

7. Feng Y., Ryan U. M., Xiao L. Genetic diversity and population structure of Cryptosporidium. Trends in parasitology. 2018; 34 (11): 997-1011. https://doi.org/10.1016/j.pt.2018.07.009

8. Kennedy G. A., Kreitner G. L., Strafuss A. C. Cryptosporidiosis in three pigs. Journal of the American Veterinary Medical Association. 1977; 170 (3): 348-350.

9. Kotloff K. L., Nataro J. P., Blackwelder W. C. et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): a prospective, case-control study. The Lancet. 2013; 382 (9888): 209-222. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(13)60844-2

10. Němejc K., Sak B., Květoňová D., Kernerová N., Rost M., Cama V. A., & Kváč M. Occurrence of Cryptosporidium suis and Cryptosporidium scrofarum on commercial swine farms in the Czech Republic and its associations with age and husbandry practices. Parasitology research. 2013; 112 (3): 1143-1154. https://doi.org/10.1007/s00436-012-3244-8

11. Pettersson E., Ahola H., Frössling J., Wallgren P., & Troell K. Detection and molecular characterisation of Cryptosporidium spp. in Swedish pigs. Acta Veterinaria Scandinavica. 2020; 62 (1): 1-7. https://doi.org/10.1186/s13028-020-00537-z

12. Qi M., Zhang Q., Xu C., Zhang Y., Xing J., Tao D., Li J., Zhang L. Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in pigs in Xinjiang, China. Acta Tropica. 2020; 209. 105551. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2020.105551

13. Rahimah A. B., Cheah S. C., Rajinder S. Freeze-drying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA. J. Oil Palm Res. 2006; 18. 296-304.

14. Ryan U. M., Feng Y., Fayer R., & Xiao L. Taxonomy and molecular epidemiology of Cryptosporidium and Giardia – a 50-year perspective (1971–2021). International Journal for Parasitology. 2021; 51 (13-14): 1099-1119. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2021.08.007

15. Striepen B. Parasitic infections: time to tackle cryptosporidiosis. Nature News. 2013; 503 (7475): 189-191. https://doi.org/10.1038/503189a

16. Wang R., Qiu S., Jian F., Zhang S., Shen Y., Zhang L., Ning C., Cao J., Qi M., Xiao L. Prevalence and molecular identification of Cryptosporidium spp. Parasitol. Res. 2010; 107. 1489-1494. https://doi.org/10.1007/s00436-010-2024-6

17. Wang W., Gong Q. L., Zeng A., Li M. H., Zhao Q., & Ni H. B. Prevalence of Cryptosporidium in pigs in China: A systematic review and meta‐analysis. Transboundary and Emerging Diseases. 2021; 68 (3): 1400-1413. https://doi.org/10.1111/tbed.13806

18. Wang P. Li, S., Zou Y., Du Z. C., Song D. P., Wang P., & Chen X. Q. The infection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in diarrheic pigs in southern China. Microbial Pathogenesis. 2022; 165. 105459 https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105459

19. Zheng S., Li D., Zhou C., Zhang S., Wu Y., Chang Y., Chen Y., Huang J., Ning C., Zhang G., Zhang L. Molecular identification and epidemiological comparison of Cryptosporidium spp. among different pig breeds in Tibet and Henan, China. BMC veterinary research. 2019; 15 (1): 1-8. https://doi.org/10.1186/s12917-019-1847-3