vniigisРоссийский паразитологический журналRussian Journal of Parasitology1998-84352541-7843ВНИИП – филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН10.31016/1998-8435-2018-12-3-47-54vniigis-480Research ArticleБИОХИМИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ДИАГНОСТИКАBIOCHEMISTRY, BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICSДиагностика анаплазмоза крупного рогатого скота методом ПЦР в реальном времениReal-Time Diagnostics of Anaplasmosis in Cattle by PCR MethodАрхиповаА. Л.ArkhipovaA. L.info-ceerb@mail.ruБабийА. В.BabiyA. V.info-ceerb@mail.ruАрхиповА. В.ArkhipovA. V.info-ceerb@mail.ruКовальчукС. Н.KovalchukS. N.info-ceerb@mail.ruЦентр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологийРоссияCenter of Experimental Embryology and Reproductive BiotechnologiesRussian Federation2018151020191234754Copyright © Архипова А.Л., Бабий А.В., Архипов А.В., Ковальчук С.Н., 20192019Архипова А.Л., Бабий А.В., Архипов А.В., Ковальчук С.Н.Arkhipova A.L., Babiy A.V., Arkhipov A.V., Kovalchuk S.N.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vniigis.elpub.ru/jour/article/view/480

Цель исследования: разработка метода ПЦР в реальном времени для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота. Материалы и методы. Для разработки праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР в реальном времени были использованы имеющиеся в базе данных Генбанк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) последовательности гена msp1α 57 изолятов Anaplasma marginale. Выявление консервативных участков гена msp1α проводили с помощью программы Сlustal Omega (https:// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Cпецифичность праймеров и зонда была проверена in silico с использованием программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) экспериментально на образцах крови животных, инфицированных анаплазмами A. ovis, A. centrale, A. bovis, A. phagocytophilum и A. platys, и секвенированием ампликонов методом Сэнгера. Для оценки чувствительности метода была использована сконструированная нами плазмида pGEM-msp1α, содержащая фрагмент гена msp1α длиной 207 п.н. Результаты и обсуждение. Разработан метод ПЦР в реальном времени для выявления возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота A. marginale. Были разработаны праймеры и флуоресцентно-меченый зонд для амплификации и детекции фрагмента гена msp1а длиной 207 п.н. и оптимизированы условия ПЦР. Чувствительность метода позволяет выявлять одну копию гена msp1а А. marginale в анализируемом образце ДНК. Специфичность метода позволяет дифференцировать A. marginale от других видов анаплазм (A. ovis, A. bovis, A. centrale, A. phagocytophilum, A. platys). Разработанный метод может быть использован для обнаружения и количественной оценки А. marginale в образцах крови инфицированных животных с целью подтверждения диагноза, а также при проведении эпизоотологического мониторинга анаплазмоза крупного рогатого скота.

The purpose of the research is real-time development of PCR method for diagnostics of anaplasmosis in cattle. Materials and methods. For real time development of primers and fluorescence-labeled probe for PCR msp1α gene sequences 57 isolates Anaplasma marginale available on database Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) were used. Conservative areas of msp1α gene were revealed with Сlustal Omega programme (https://www.ebi.ac .uk/Tools/msa/clustalo/). Specificity of primers and probe were checked experimentally in silico using BLASTN programme (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) on the animals’ blood samples infected by AnaplasmaA. ovis, A. centrale, A. bovis, A. phagocytophilum и A. platys, and sequence analysis of amplicon by Sanger’s method. pGEM-msp1α plasmid designed by us containing msp1α gene fragment with a length of 207 bps was used to assess of sensitivity of the method. Results and discussion. PCR method has been developed in real time mode to detect A. marginale anaplasmosis agent in cattle. Primers and fluorescence-labeled probe have been developed to amplify and detect msp1α gene fragment with a length of 207 bps and PCR conditions have been optimized. Sensitivity of the method allows to detect one copy of msp1а gene copy of А. marginale in analysed DNA sample. Specificity of method allows to differentiate A. marginale from other anaplasma types (A. ovis, A. bovis, A. centrale, A. phagocytophilum, A. platys). The developed method can be used to detect and assess А. Marginale quantitatively in blood samples of infected animals in order to prove the diagnosis as well as to perform epizootological monitoring of anaplasmosis in cattle.

крупный рогатый скотанаплазмозAnaplasma marginaleПЦР в реальном времениcattleanaplasmosisAnaplasma marginalePCR in real time modeReferencesГеоргиу Х., Белименко В. В. Анаплазмоз крупного рогатого скота // Рос. вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. 2015. № 1. С. 5-7Георгиу Х., Белименко В. В. Анаплазмоз крупного рогатого скота // Рос. вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. 2015. № 1. С. 5-7Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) // Рос. вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013. № 2. С. 36-40Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) // Рос. вет. журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013. № 2. С. 36-40Казаков Н. А., Идина М. Ф. Анаплазмоз крупного рогатого скота в Тверской области // Ветеринарная патология. 2009. № 2. С. 72-75Казаков Н. А., Идина М. Ф. Анаплазмоз крупного рогатого скота в Тверской области // Ветеринарная патология. 2009. № 2. С. 72-75Казакова Е. В., Ясюкевич В. В., Попов И. О., Семенов С. М. Распространение клещей Ixodes ricinus L., 1758 и Ixodes persulcatus Shulze, 1930 (Parasitiformes, Ixodidae) на территории России и соседних стран и наблюдаемые изменения климата // Доклады Академии наук. 2009. № 5. С. 688-692Казакова Е. В., Ясюкевич В. В., Попов И. О., Семенов С. М. Распространение клещей Ixodes ricinus L., 1758 и Ixodes persulcatus Shulze, 1930 (Parasitiformes, Ixodidae) на территории России и соседних стран и наблюдаемые изменения климата // Доклады Академии наук. 2009. № 5. С. 688-692Ковальчук С. Н., Бабий А. В., Архипова А. Л., Архипов А. В. Косовский Г. Ю. Оценка уровня паразитемии методом ПЦРвреальном времени при анаплазмозе крупного рогатого скота // Проблемы биологии продуктивных животных. 2016. № 3. С. 98-105Ковальчук С. Н., Бабий А. В., Архипова А. Л., Архипов А. В. Косовский Г. Ю. Оценка уровня паразитемии методом ПЦРвреальном времени при анаплазмозе крупного рогатого скота // Проблемы биологии продуктивных животных. 2016. № 3. С. 98-105Либерман Е. Л., Хлызова Т. А. Зависимость инвазирования крупного рогатого скота анаплазмозом от численности насекомых комплекса «Гнус» // Educatio. 2015. № 3. С. 46-50Либерман Е. Л., Хлызова Т. А. Зависимость инвазирования крупного рогатого скота анаплазмозом от численности насекомых комплекса «Гнус» // Educatio. 2015. № 3. С. 46-50Мальцева О. Е. Анаплазмоз крупного рогатого скота в Центральном регионе РФ (эпизоотология, вакцинопрофилактика, химиотерапия и меры борьбы): автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2004. 15 сМальцева О. Е. Анаплазмоз крупного рогатого скота в Центральном регионе РФ (эпизоотология, вакцинопрофилактика, химиотерапия и меры борьбы): автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2004. 15 сМинасян В. Г., Ткаченко Ю. Г., Идина М. Ф. Методы лечения коров больных анаплазмозом // Ветеринарная патология. 2009. № 4. С. 82-85Минасян В. Г., Ткаченко Ю. Г., Идина М. Ф. Методы лечения коров больных анаплазмозом // Ветеринарная патология. 2009. № 4. С. 82-85Самуйленко А. Я., Гулюкин М. И., Василевич Ф. И., Ковальчук С. Н., Глазко Т. Т., Бабий А. В., Архипов А. В., Косовский Г. Ю. ДНК-диагностика анаплазмоза крупного рогатого скота // Российский паразитологический журнал. 2015. № 4. С. 72-78Самуйленко А. Я., Гулюкин М. И., Василевич Ф. И., Ковальчук С. Н., Глазко Т. Т., Бабий А. В., Архипов А. В., Косовский Г. Ю. ДНК-диагностика анаплазмоза крупного рогатого скота // Российский паразитологический журнал. 2015. № 4. С. 72-78Bilgiç H. B., Karagenç T., Simuunza M., Shiels B., Tait A., Eren H., Weir. W. Development of multiplex PCR assay for simultaneous detection of Theileria annulata, Babesia bovis and Anaplasma marginale in cattle // Exp. Parasitol. 2013. № 133(2). Р. 222-229Bilgiç H. B., Karagenç T., Simuunza M., Shiels B., Tait A., Eren H., Weir. W. Development of multiplex PCR assay for simultaneous detection of Theileria annulata, Babesia bovis and Anaplasma marginale in cattle // Exp. Parasitol. 2013. № 133(2). Р. 222-229Brayton K. A., Kappmeyer L. S., Herndon D. R., Dark M. J., Tibbals D. L., Palmer G. H., McGuire T. C., Knowles D. P. Jr. Complete genome sequencing of Anaplasma marginale reveals that the surface is skewed to two superfamilies of outer membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sc.i U S A. 2005. № 102. Р. 844-849Brayton K. A., Kappmeyer L. S., Herndon D. R., Dark M. J., Tibbals D. L., Palmer G. H., McGuire T. C., Knowles D. P. Jr. Complete genome sequencing of Anaplasma marginale reveals that the surface is skewed to two superfamilies of outer membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sc.i U S A. 2005. № 102. Р. 844-849CarelliG.,DecaroN.,LorussoA.,EliaG.,LorussoE., Mari V., Ceci L., Buonavoglia C. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR // Vet. Microbiol. 2007. Vol. 124. P. 107-114CarelliG.,DecaroN.,LorussoA.,EliaG.,LorussoE., Mari V., Ceci L., Buonavoglia C. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR // Vet. Microbiol. 2007. Vol. 124. P. 107-114de la Fuente J., Massung R. F., Wong S. J., Chu F. K., Lutz H., Meli M. et al. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 1309- 1317de la Fuente J., Massung R. F., Wong S. J., Chu F. K., Lutz H., Meli M. et al. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 1309- 1317Decaro N., Carelli G., Lorusso E., Lucente M. S., Greco G., Lorusso A., Radogna A., Ceci L., Buonavoglia C. Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale // J. Vet. Diagn. Invest. 2008. Vol. 20. 606-611Decaro N., Carelli G., Lorusso E., Lucente M. S., Greco G., Lorusso A., Radogna A., Ceci L., Buonavoglia C. Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale // J. Vet. Diagn. Invest. 2008. Vol. 20. 606-611Dreher U. M., Fuente J., Hofmann-Lehmann R., Meli M. L., Pusterla N., Kocan K. M., Woldehiwet Z., Braun U., Regula G., Staerk K. D., Lutz H. Serologic crossreactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. № 12. Р. 1177- 1183Dreher U. M., Fuente J., Hofmann-Lehmann R., Meli M. L., Pusterla N., Kocan K. M., Woldehiwet Z., Braun U., Regula G., Staerk K. D., Lutz H. Serologic crossreactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. № 12. Р. 1177- 1183Inokuma H., Raoult D., Brouqui P. Detection of Ehrlichia platys DNA in brown dog ticks (Rhipicephalus sanguineus) in Okinawa Island, Japan // J. Clin. Microbiol. 2000. № 38. С. 4219- 4221Inokuma H., Raoult D., Brouqui P. Detection of Ehrlichia platys DNA in brown dog ticks (Rhipicephalus sanguineus) in Okinawa Island, Japan // J. Clin. Microbiol. 2000. № 38. С. 4219- 4221KawaharaM.,RikihisaY.,LinQ.,IsogaiE.,TaharaK., Itagaki A., Hiramitsu Y., Tajima T. Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma bovis, Anaplasma centrale, and a novel Ehrlichia sp. in wild deer and ticks on two major islands in Japan // Appl. Environ. Microbiol. 2006. № 72. Р. 1102-1109KawaharaM.,RikihisaY.,LinQ.,IsogaiE.,TaharaK., Itagaki A., Hiramitsu Y., Tajima T. Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma bovis, Anaplasma centrale, and a novel Ehrlichia sp. in wild deer and ticks on two major islands in Japan // Appl. Environ. Microbiol. 2006. № 72. Р. 1102-1109Kivaria F. M. Estimated direct economic costs associated with tick-borne diseases on cattle in Tanzania // Trop. Anim. Health Prod. 2006. V. 38. P. 291-299Kivaria F. M. Estimated direct economic costs associated with tick-borne diseases on cattle in Tanzania // Trop. Anim. Health Prod. 2006. V. 38. P. 291-299Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F., Coetzee J. F., Ewing S. A. The natural history of Anaplasma marginale // Veterinary parasitology. 2010. V. 167. P. 95-107Kocan K. M., de la Fuente J., Blouin E. F., Coetzee J. F., Ewing S. A. The natural history of Anaplasma marginale // Veterinary parasitology. 2010. V. 167. P. 95-107Kocan K. M., J. de la Fuente J., Guglielmone A. A., Melendez R. D. Antigens and alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle // Clin. Microbiol. Rev. 2003. V. 16. Р. 698- 712Kocan K. M., J. de la Fuente J., Guglielmone A. A., Melendez R. D. Antigens and alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle // Clin. Microbiol. Rev. 2003. V. 16. Р. 698- 712Löhr C. V., Rurangirwa F. R., McElwain T. F., Stiller D., Palmer G. H. Specific expression of Anaplasma marginale major surface protein 2 salivary gland variants occurs in the midgut and is an early event during tick transmission // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 114-120Löhr C. V., Rurangirwa F. R., McElwain T. F., Stiller D., Palmer G. H. Specific expression of Anaplasma marginale major surface protein 2 salivary gland variants occurs in the midgut and is an early event during tick transmission // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 114-120Picoloto G., Lima R. F., Olegário L. A., Carvalho C. M., Lacerda A. C., Tomás W. M., Borges P. A., Pellegrin A. O., Madruga C. R. Real-time polymerase chain reaction to diagnose Anaplasma marginale in cattle and deer (Ozotoceros bezoarticus leucogaster) of the Brazilian Pantanal // Rev. Bras. Parasitol. Vet. 2010.Vol. 19. P. 186-188Picoloto G., Lima R. F., Olegário L. A., Carvalho C. M., Lacerda A. C., Tomás W. M., Borges P. A., Pellegrin A. O., Madruga C. R. Real-time polymerase chain reaction to diagnose Anaplasma marginale in cattle and deer (Ozotoceros bezoarticus leucogaster) of the Brazilian Pantanal // Rev. Bras. Parasitol. Vet. 2010.Vol. 19. P. 186-188Reinbold J. B., Coetzee J. F., Sirigireddy K. R., Ganta R. R. Detection of Anaplasma marginale and A.phagocytophilum in bovine peripheral blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay // J. Clin. Microbiol. 2010. Vol 48. P. 2424-2432Reinbold J. B., Coetzee J. F., Sirigireddy K. R., Ganta R. R. Detection of Anaplasma marginale and A.phagocytophilum in bovine peripheral blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay // J. Clin. Microbiol. 2010. Vol 48. P. 2424-2432Strik N. I., Alleman A. R., Barbet A. F., Sorenson H. L., Wamsley H. L., Gaschen F. P., Luckschander N., Wong S., Chu F., Foley J. E., Bjoersdorff A., Stuen S., Knowles D. P. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale // Clin. Vaccine. Immunol. 2007. V. 14. P. 262-268Strik N. I., Alleman A. R., Barbet A. F., Sorenson H. L., Wamsley H. L., Gaschen F. P., Luckschander N., Wong S., Chu F., Foley J. E., Bjoersdorff A., Stuen S., Knowles D. P. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale // Clin. Vaccine. Immunol. 2007. V. 14. P. 262-268Torina A., Agnone A., Blanda V., Alongi A., D’Agostino R., Caracappa S., Marino A. M., Di Marco V., de la Fuente J. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale // Ticks Tick Borne. Dis. 2012. V. 3. P. 283-287Torina A., Agnone A., Blanda V., Alongi A., D’Agostino R., Caracappa S., Marino A. M., Di Marco V., de la Fuente J. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale // Ticks Tick Borne. Dis. 2012. V. 3. P. 283-287Wall D. T. Anaplasmosis control and diagnosis in South Africa // Ann N Y Acad Sci. 2000. № 916. P. 474-83Wall D. T. Anaplasmosis control and diagnosis in South Africa // Ann N Y Acad Sci. 2000. № 916. P. 474-83Ybañez A. P., Sivakumar T., Ybañez R. H. D., Ratilla J. C., Perez Z. O., Gabotero S. R., Hakimi H., Kawazu S., Matsumoto K., Yokoyama N., Inokuma H. First molecular characterization of Anaplasma marginale in cattle and Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks in Cebu, Philippines // J. Vet. Med. Sci. 2013. V. 75. P. 27-36Ybañez A. P., Sivakumar T., Ybañez R. H. D., Ratilla J. C., Perez Z. O., Gabotero S. R., Hakimi H., Kawazu S., Matsumoto K., Yokoyama N., Inokuma H. First molecular characterization of Anaplasma marginale in cattle and Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks in Cebu, Philippines // J. Vet. Med. Sci. 2013. V. 75. P. 27-36

The authors declare that there are no conflicts of interest present.