Кряжев Андрей Леонидович, Кряжев Андрей Леонидович
160555, г. Вологда, п. Молочное, ул. Шмидта, 2160555, г. Вологда, п. Молочное, ул. Шмидта, 2
Kryazhev Andrey L., Doctor of Veterinary Sciences
2 Shmidta Str., Molochnoye Village, Vologda, 160555
Новиков Артём Сергеевич, кандидат ветеринарных наук
160555, г. Вологда, п. Молочное, ул. Шмидта, 2
Novikov Artem S., Candidate of Veterinary Sciences
2 Shmidta Str., Molochnoye Village, Vologda, 160555
Цель исследований – выделение, идентификация и анализ типов ASV (Amplicon Sequence Variant) криптоспоридий свиней в условиях Вологодской области РФ.
Материалы и методы. Исследования в Российской Федерации выполнены впервые. Исследования проводили в свиноводческих хозяйствах на территории Вологодской области Северо-Западного федерального округа РФ в период с января по октябрь 2023 г. Фекалии получали от поросят различных возрастов, а также от подсосных свиноматок. Пробы исследовали с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Идентификацию видов рода Cryptosporidium в пробах фекалий проводили с помощью высокопроизводительного секвенирования ампликонных библиотек фрагментов гена 18S рРНК, полученных в результате проведения nested (вложенной) ПЦР с последующим «деноизингом», объединением последовательностей, восстановления исходных филотипов (ASV, (Amplicon Sequence Variant)).
Результаты и обсуждение. Представители рода Cryptosporidium были выявлены в каждой исследуемой возрастной группе. В результате высокопроизводительного секвенирования библиотек по технологии Illumina для каждого образца было получено от 20 до 100 тыс. нуклеотидных последовательностей (прочтений), после обработки которых суммарно было выявлено 2372 ASV. Анализ таксономической принадлежности ASV, проведённый с помощью филогенетического анализа, дополненного анализом с использованием алгоритма blastn в базе данных GenBank, показал, что суммарно во всех исследованных образцах присутствуют только 10 ASV, имеющих высокое сходство с последовательностями, депонированными в GenBank как фрагменты гена 18S рРНК Cryptosporidium scrofarum. 8 типов ASV являются уникальными и не повторяются от хозяйства к хозяйству. Вероятно, эти последовательности принадлежат местным популяциям подвидов C. scrofarum. Интересным представляется обнаружение уникальной последовательности рода Cryptosporidium типа ASV8, сходство которого с ближайшим родственником рода составляет всего 91,47%, что может свидетельствовать о довольно удалённом таксономическом родстве. Данный тип нуклеотидной последовательности в дальнейшем может быть описан как новый вид. Все выявленные уникальные нуклеотидные последовательности ASV были депонированы в GenBank.
The purpose of the research is isolation, identification, and analysis of ASV (Amplicon Sequence Variant) types of Cryptosporidia spp. in pigs in the Vologda Region of the Russian Federation.
Materials and methods. The research has been conducted in the Russian Federation for the first time. The research was conducted on pig farms in the Vologda Region of the Northwestern Federal District of the Russian Federation from January to October 2023. Feces were taken from piglets of various age groups, as well as milking sows. The samples were studied using the equipment of the resource center “Genomic Technologies, Proteomics and Cell Biology” of ARRIAM. Species of the genus Cryptosporidia were identified in fecal samples using high-throughput sequencing of 18S rRNA gene fragment amplicon libraries as obtained from nested PCR followed by “denoising”, sequence combining, and restoring the original phylotypes (ASV, (Amplicon Sequence Variant)).
Results and discussion. Cryptosporidia spp. species were identified in each age group studied. As a result of high-throughput sequencing of the libraries using the Illumina technology, 20 to 100 thousand nucleotide sequences (reads) were obtained for each sample after processing of which a total of 2,372 ASVs were identified. The analysis of the ASV taxonomic affiliation performed with phylogenetic analysis supplemented by an analysis using the blastn algorithm in the GenBank database showed that, in total, 10 ASVs were only present in all studied samples that had high similarity to sequences deposited in the GenBank as 18S rRNA gene fragments of Cryptosporidium scrofarum. Eight ASV types were unique and did not repeat from farm to farm. Probably, these sequences belong to local populations of C. scrofarum subspecies. Of interest is the discovery of a unique Cryptosporidium sequence of ASV8 type which is only 91.47% similar to the closest relative of the genus, which may indicate a rather distant taxonomic relationship. This type of nucleotide sequence can be further described as a new species. All identified unique ASV nucleotide sequences were deposited in GenBank.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.